Quartz-Seq用のライブラリ作製方法LIMprepにおける注意点

以前から配布しているシーケンスライブラリ作製の方法LIMprepのプロトコルに関してですが、これは微量なdsDNA用に作ったものでQuartz-Seq用のLIMprepでは若干プロトコルが違っています。ですのでQuartz-Seq用のLIMprepで間違いがおきないために配布します。よろしくお願いします。違うところは精製の部分です。

なぜ違うかは以下詳細です。
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Quartz-Seqでは増幅したcDNAをCovarisによって断片化していますが、理由があって非常にきつい条件で行なっており、短い断片化されたDNAが出てきます。論文にもちょっと書きましたが、原理的には短いトランスクリプト由来cDNAのほうが長いトランスクリプト由来cDNAに比べて、シーケンスライブラリ作製に有効な断片化DNAが出てきにくいという特徴があります。cDNAの両端はアミノ化されておりライゲーション反応にかからないよう設計されており、両端が断片化によって生まれたものがライブラリ作製にかかるという寸法であるので、長いDNAから二箇所切れるより、短いDNAから二箇所切れるほうが難しいというだけのことです。そのためできるだけ短いものからも有効な断片化DNAをえたいがために、きつい断片化の条件になっています。

短いトランスクリプトの検出感度上昇を期待しているということです。

Agencourt Ampure XPの通常の精製法では、短い断片化DNA < 100 bpはロスしてしまうため、Quartz-Seq用LIMprepではAmpure XPはサイズセレクションしか使っていません。またサイズセレクションですが、サイズセレクションしたい液のボリュームに対して当量のAmpure XPを加えるというのが一般的ですが、それでは短いインサート由来のシーケンスライブラリDNAが除かれてしまいます。DNAの分布が精製後変わらないように、1.2倍もしくは1.4倍のAmpure XPを加えるように改変しています。
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NGS MagnaStand 8Ch for 2-6 ul ultra low volume

NGS MagnaStand 8Chが2-6 ulという微少ボリュームでも機能するか試しました。少しコツが必要ですができることがわかりました。磁気ビーズを保持したまま、ほとんどの液を回収することができました。0.1 ml PCRチューブを使う必要があります。

動画は以下から見ることができます。
https://www.youtube.com/watch?v=KtgNrGhIKto

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会社: 日本ジェネティクス (http://www.n-genetics.com/contact.html)
商品番号: FG-SSMAG
商品名: NGS MagnaStand 8Ch（YS-Model)
価格: ￥47,000
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I tested whether "NGS MagnaStand 8Ch" work for ultra low volume (2-6 ul) or not. As a result, "NGS MagnaStand 8Ch" work well for ultra low volume (2-6 ul).

Please see the movie.
https://www.youtube.com/watch?v=KtgNrGhIKto

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Company: Nippongenetics (http://www.nippongenetics.eu/contact/)
Product number: FG-SSMAG
Product name: NGS MagnaStand 8Ch（YS-Model)
Price: ￥47,000
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Quartz WTA protocol for 100 pg - 1 ng total RNA

集団サンプル用のQuartz増幅プロトコルを公開しました。以下ダウンロード出来ます。

I prepared two type of Quartz WTA protocol for 100 pg - 1ng total RNA.

Whole-transcript amplification for population Quartz-Seq (vCellDirect)

Whole-transcript amplification for population Quartz-Seq (vPurifiedRNA)

微量サンプル用マグネットスタンドの商品化

ルーチンに微量サンプルから次世代シーケンス用のライブラリ作製する際に、マグネットスタンドの磁力・位置に問題・ストレスを感じ、微量サンプルに向いたマグネットスタンドがなかったので、日本ジェネティクス社のすみかわさんと相談し商品化までして頂きました。自分が困って自分のために作ってもらいましたが、良い物なのでおすすめできるかなと。興味があれば以下購入可能です。

  型番；FG-SSMAG
  品名；NGS MagnaStand 8Ch（YS-Model)
  定価；￥47,000-

既成品と比べてNGS MagnaStand 8Chは早くマグネットビーズを集めることができ、少ないボリュームでも最適な位置にマグネットビーズを保持することができます。ストレス減少・性能向上に貢献してくれると思います。

プロトタイプを用いた、比較動画ですが以下から見ることができます。暇な時に見てください。商品の方はさらにフォールドが改善しています。

既成品 VS NGS MagnaStand 8Ch (25 ul, 50 ul, 100 ul, 200 ul)
https://www.youtube.com/watch?v=fn3dIdNY2lg

NGS MagnaStand 8Ch　(ピペッティング)
https://www.youtube.com/watch?v=A4M832Wl6n8

既成品 （ピペッティング）
https://www.youtube.com/watch?v=0WPJkHZSUpI

NGS MagnaStand 8Ch (100 ul x 8 tube)
https://www.youtube.com/watch?v=KRz2W_KgzlE

Quartz WTA protocol (Original)

Single-cell Quartz-SeqのcDNA増幅(Whole-transcript amplification)のプロトコルをダウンロード出来るようにしました。ラボホームからもダウンロード出来ます。活用してください。

I prepared Quartz WTA protocol for enduser. You can download Quartz WTA protocol (Original version).  Good luck with your single-cell project.